СolonelСassad (colonelcassad) wrote,
СolonelСassad
colonelcassad

Categories:

Тесты на антитела против коронавируса. Декларации и реальность.



Тесты на антитела против коронавируса. Декларации и реальность.

Похоже что наступил бум антительных тестов. В США на рынок вышло более 70 типов тестов на антитела против SARS-CoV-2. То же происходит и во многих других странах, хотя и в меньших масштабах. В России один тест на антитела (производитель – «Вектор») уже разрешен и несколько других близки к этому. Одновременно, на многочисленных ток-шоу, со свойственной им «глубиной погружения в проблему и всеобъемлющей компетентностью», обсуждаются различные характеристики этих тестов. Не могу остаться в стороне и я, тем более, что читатели блога меня об этих тестах спрашивают. Я также рекомендую ознакомиться с предыдущими постами на эту тему (от 29-3-2020 https://prof-afv.livejournal.com/8405.html ; от 6-4-2020 https://prof-afv.livejournal.com/8405.html).

Начну с аналогии. Представьте, вам предлагают картину и говорят, что она замечательная. Вы, естественно, хотите на неё взглянуть. Тогда вас заводят в абсолютно тёмную комнату и говорят: «Она перед вами». «Но мне ничего не видно» говорите вы. В ответ звучит: «Вы что нам не доверяете? И, вообще, вы в живописи что-то понимаете, чтобы судить замечательная картина или нет?»

Как и в любой аналогии полного совпадения нет, но, в принципе, это очень похоже на мое положение, когда просят прокомментировать антительные тесты различных производителей, в том числе и российских. Поверьте, в антительных тестах (как и ПЦР) я кое-что понимаю. И мне не достаточно утверждения, «что тест определяет иммунитет против коронавируса». Чтобы судить обоснованно, нужно знать детали, но не второстепенные (типа «маленькая коробочка с дырочкой» или «96-луночная пластиночка»), а те, по которым действительно можно судить о возможностях теста. Относительно отечественных тест-систем, такой информации нет, по крайней мере, в открытых для публики источниках (научные публикации и СМИ).

Но что же это за детали, по которым можно судить о возможностях теста? В этом посте, я расскажу о них на примере работы, опубликованной в MedRxiv https://doi.org/10.1101/2020.03.17.20037713

Пока это препринт и статья ещё не прошла процедуру рецензирования. Авторский коллектив, включает учёных из США, Австрии, Австралии, Финляндии и Швейцарии. На мой взгляд, эта работа сделана великолепно. Я не ставлю целью дать исчерпывающее описание содержания этой статьи, а фокусирую внимание на моментах, имеющих общее значение для всех антительных тестов.

1. Качество теста на антитела прежде всего определяется «адекватностью» использованного антигена.

Чтобы «правильно» обнаруживать противовирусные антитела, антиген (для вирусов это всегда белок или его фрагмент), использованный в тест-системе должен минимально отличаться от того, как он «выглядит» будучи составной частью вируса. В подавляющем большинстве антительных тестов на анти-SARS-CoV-2, которые вышли на рынок, в качестве антигена использованы различные препараты гликопротеина S (gp-S) этого вируса. Этот белок является основным компонентов оболочки SARS-CoV-2 и с его помощью вирус «швартуется» к рецептору (ACE2). Антитела, нейтрализующие инфекционность SARS-CoV-2, направлены против gp-S . В качестве антигена во всех тестах используется не природный, а рекомбинантные gp-S или его фрагменты. Существуют разные системы для получения и наработки рекомбинантных белков (бактерии, дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих). Рекомбинантный белок, полученный в разных клеточных системах, не идентичен оригиналу и в каждой из этих систем он может быть модифицирован по разному. Эти модификации (например гликозилирование) не меняют аминокислотную последовательность белка, но они могут оказать влияние на его взаимодействие с антителами. Кроме этого, в разных системах в аминокислотную последовательность белка могут быть внесены некоторые «технологические элементы», которые, теоретически, не меняют антигенность белка, но обязательно должно быть проверено, что это реально так.

В данной работе в качестве антигена использовались 4 рекомбинантных продукта: «полноразмерный gp-S» и его фрагмент, который называется RBD (receptor-binding domain – домен связывания с рецептором), каждый в двух вариантах – из клеток насекомых и из клеток млекопитающих. Нужно отметить (это очень важно!), что в оболочке вируса gp-S присутствует не как моно-белок, а как тример (три идентичных субъединицы, собранные в единую структуру). Сделать рекомбинантный тример намного сложнее, чем мономер. И авторам это удалось. На сегодняшний день мне неизвестно, чтобы это удалось кому-либо ещё. Как выглядит gp-S видно на рисунке. Все картинки в этом блоге взяты из обсуждаемой работы. Красным цветом обозначен фрагмент RBD.



Полученные рекомбинантные белки были очищены практически до гомогенности (см рис. ниже). На нем Spike это тример полноразмерного gp-S, а RBD это рекомбинантный фрагмент RBD; i – insect; m – mammalian обозначают рекомбинантные белки из клеток насекомых и млекопитающих, соответственно.



2. Как работает ИФА тест на антитела.

Полученные антигены были использованы по стандартной схеме, так-называемого твердофазного иммуно-ферментного анализа (ИФА, международное название ELISA). Этот вариант ИФА был разработан в общем виде еще в 1971г шведскими иммунологами Eva Engvall и Peter Perlmann и с тех пор, в почти неизменном виде, используется в тысячах тест-систем, как исследовательских, так и коммерческих. Если очень коротко, то схема анализа следующая: к твердой фазе (пластик) «привязывают» антиген; далее добавляют антитела, которые связываются с антигеном; далее добавляют реагент, который может специфически связываться с требуемым видом и классом иммуноглобулина (все антитела это иммуноглобулины); к этому реагенту «прикреплён» фермент, который способен бесцветный субстрат превращать в окрашенный. Таким образом, если специфические антитела есть (т.е. антитела, которые связываются с антигеном – «первый слой»), то появляется окраска; если антител нет, многослойный «сэндвич» не выстраивается и окраски нет.

3. Доказательства аналитической специфичности тест-системы.

Тест-система специфична, если она обнаруживает только те антитела, для определения которых она предназначена. Для тест-системы на антитела против SARS-CoV-2 для подтверждения её специфичности должны быть выполнены следующие условия а) образцы заведомо не содержащие антитела против SARS-CoV-2 должны быть четко отрицательны; б) образцы от больных COVID-19 (диагноз подтверждён) должны быть положительны;
в) при исследовании серийных образцов, взятых от инфицированных людей на начальных и поздних стадиях заболевания должен регистрироваться переход от антитело-отрицательности к антитело-положительности; это называется сероконверсия). Кстати, сероконверсия, если она убедительно продемонстрирована, является таким же надёжным диагностическим признаком SARS-CoV-2 инфекции, как и обнаружение вирусной РНК. Все эти условия были выполнены, что детально задокументировано в статье. На рисунке ниже представлены данные об ИФА реактивности заведомо отрицательных образцов (черные кружки) и положительных контролей (сыворотки больных после сероконверсии — красные прямоугольники). Отчетливо видно, что тест-система хорошо отличает положительные образцы от отрицательных. Особенно эффективен в этом отношении антиген mSpike (тример полноразмерного gp-S, полученного в клетках млекопитающих).



Помимо SARS-CoV-2 , MERS-CoV и «пропавшего без вести» SARS-CoV-1, у человека есть ещё 4 коронавируса, вызывающих «сезонные» ОРВИ. Один из этих вирусов (NL-63) при инфицировании клеток человека «швартуется» к тому же рецептору что и SARS-CoV-2, т.е. к ACE2. Сыворотки людей, содержащие антитела к gp-S этих 4-х коронавирусов (особенно важно, что это было сделано и с NL-63) были проверены в разрабатываемой тест-системе и все они были отрицательны.

4. Корреляция титров ИФА и вирус-нейтрализующих антител.

Вирус-нейтрализующие антитела это «самые желанные» противовирусные антитела. Именно их нужно тестировать в плазме реконвалесцентов, которая всё шире используется для лечения COVID-19. Кроме этого, именно вирус-нейтрализующие антитела являются главным кандидатом в «индикаторы иммунитета» против SARS-CoV-2. Но тест на вирус-нейтрализующие антитела очень трудоёмкий, длительный (несколько дней) и требует специальных лабораторных условий для работы с живым вирусом. А ИФА это быстрый и относительно простой тест. Проблема состоит в том, что добиться высокой корреляции между титрами ИФА и вирус-нейтрализующих антител пока не удавалось. А чаще этот вопрос вообще не изучался, из-за трудоёмкости постановки реакции нейтрализации. В единственной работе, где корреляция между ИФА и нейтрализующими антителами была до этого исследована, коэффициент корреляции был низким (0.51-0.43, в зависимости от использованного антигена) (https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20047365).

А в обсуждаемой работе при использовании антигена mSpike корреляция оказалась очень высокой - коэффициент корреляции 0.93 (напомню, что максимальная величина коэффициента корреляции - 1.0). Таким образом, ИФА тест-систему с данным антигеном можно использовать для отбора образцов плазмы реконвалесцентов, подходящих для терапевтического применения. В перспективе же, если будет доказано что вирус-нейтрализующие антитела «маркируют» наличие иммунитета к вирусу, то для тестирования «на иммунитет против SARS-CoV-2» можно будет применять антиген mSpike.

5. «Мелочи» - удобство и практичность тест-системы.

Когда у больного берется кровь, она может быть взята в пробирку с антикоагулянтом или без него. В первом случае можно будет получить плазму крови, а во втором сыворотку. В антительных тестах традиционно используют сыворотку крови. Но чаще кровь из вены берут в пробирку с антикоагулянтом. В данной работа доказано, что в их тест-системе можно использовать и сыворотку и плазму крови, разницы нет. Это очень удобно в практике.

Кровь больных COVID-19 может быть заразной. В работе показано, что без всякого ущерба для характеристик теста, образцы сыворотки или плазмы могут быть прогреты до 56 градусов С в течение 1 часа. Эта обработка полностью инактивирует вирус. Нужно ли говорить насколько это повышает безопасность для сотрудников серологической лаборатории.

6. Авторы не коммерциализируют разработанные ими антигены!

Авторы работы уже передали разработанные ими антигены в более чем 200 лабораторий по всему миру и предлагают их всем, кто заинтересован. Полагаю, при условии, что они не будут использоваться в коммерческих целях.

Резюмирую, для того, чтобы оценить тест-систему для определения антител против SARS-CoV-2 необходимо, чтобы в научном публичном пространстве были доступны данные, аналогичные тем, что представлены в работе, о которой шла речь в этом посте.

https://prof-afv.livejournal.com/10628.html - цинк

Плюс интервью с Виталием Васильевичем Зверевым. Вирусологом, профессором, академиком РАН, научным руководителем НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, заведующим кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии Сеченовского Университета на тему медицинских аспектов коронавирусной эпидемии, а также перспектив появления вакцины.



PS. Из прочего стоит отметить, что Китай поставит в Россию 1,6 млн. костюмов индивидуальной защиты для медиков, который Россия закупает через специальный фонд.

Tags: болезни, видео, вирусология, коронавирус, медицина, наука
Subscribe

Posts from This Journal “коронавирус” Tag

promo colonelcassad june 11, 2019 17:10 177
Buy for 750 tokens
На днях пересекся в Севастополя с Максимом Григорьевым, которого хорошо знаю еще по 2014-2015 году, когда он подготовил два отличных отчета, где были задокументированы военные преступления, пытки и факты жестокого обращения со стороны ВСУ, СБУ и МВД Украины за 2014-2015 года…
  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your IP address will be recorded 

  • 227 comments
Previous
← Ctrl ← Alt
Next
Ctrl → Alt →
Previous
← Ctrl ← Alt
Next
Ctrl → Alt →